מיקרוסקופים פלורסנטים משמשים לעתים קרובות בביולוגיה וברפואה כדי לחקור תאים ורקמות, כמו גם במדעי החומרים כדי לנתח את ההרכב והמבנה של חומרים.
למה משמשים מיקרוסקופים פלורסנטים?
מיקרוסקופים פלורסנטים נמצאים בשימוש נרחב במגוון תחומים, כולל ביולוגיה, רפואה ומדעי החומרים. בביולוגיה וברפואה, הם משמשים לחקר תאים ורקמות ברמה התאית והמולקולרית, ולהדמיית ביומולקולות ספציפיות כגון חלבונים וחומצות גרעין. ניתן להשתמש במיקרוסקופים פלורסנטים כדי לחקור את המבנה והתפקוד של תאים ורקמות, כמו גם לנתח שינויים בתאים ורקמות בתגובה לגירויים שונים, כגון תרופות או מחלות.
במדעי החומרים משתמשים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים כדי לחקור את המבנה וההרכב של חומרים במיקרוסקאלה. ניתן להשתמש בהם כדי לנתח את ההפצה והסידור של רכיבים שונים בתוך חומר, כמו גם כדי ללמוד את התכונות וההתנהגות של חומרים בתנאים שונים.
בסך הכל, מיקרוסקופים פלורסנטים הם כלים שימושיים לחקר מגוון רחב של תופעות בקנה מידה מיקרו, והם נמצאים בשימוש נרחב במחקר ובמסגרות תעשייתיות.
מהו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא אחת הטכניקות החשובות ביותר במעבדות מחקר ודיאגנוסטיקה מודרניות. בשונה ממיקרוסקופ אור רגיל המשתמש באור נראה כדי להאיר דגימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי משתמש באור בעל אנרגיה גבוהה )אור מעורר( כדי לגרום למולקולות ספציפיות בדגימה "להאיר" בחזרה.
איך זה עובד מבחינה אופטית?
התהליך מתבסס על תופעת הפלואורסצנציה:
.1 עירור :(Excitation) המערכת מקרינה אור באורך גל קצר וספציפי )למשל כחול( על הדגימה.
.2 פליטה :(Emission) חלבונים מסומנים או צבעים פלואורסצנטיים בדגימה סופגים את האור ופולטים אור באורך גל ארוך יותר )למשל ירוק.(
.3 הפרדה: פילטרים מיוחדים חוסמים את האור המעורר ומאפשרים רק לאור הנפלט להגיע לעין או למצלמה, מה שיוצר תמונה של אובייקטים זוהרים על רקע שחור.
המרכיבים העיקריים:
● מקור אור עוצמתי: בדרך כלל נורות כספית, קסנון או לייזריםLED/ מתקדמים.
● מסנני עירור Filters) :(Excitation מאפשרים רק לאור באורך הגל הרצוי להגיע לדגימה.
● מראה דיכרואיטית Mirror) :(Dichroic מראה מתוחכמת שמחזירה אור באורך גל אחד )המעורר( ומעבירה דרכה אור באורך גל אחר )הנפלט מהדגימה.(
● מסנני פליטה Filters) :(Emission מבטיחים שרק האור שנפלט מהדגימה יגיע לעין או למצלמה, תוך חסימת אור הרקע
למה המעבדה צריכה פלואורסצנציה?
הצורך במיקרוסקופ פלואורסצנציה במעבדה נובע מכך שרוב המבנים בתוך התא הם שקופים לחלוטין. במיקרוסקופ אור רגיל, התא נראה כמו "שלולית" שקופה שקשה להבחין בפרטים בתוכה.
הנה הסיבות המרכזיות מדוע המעבדה המודרנית לא יכולה להסתדר בלי הטכנולוגיה הזו:
.1 היכולת לראות את "הבלתי נראה" )ניגודיות(
במיקרוסקופיה רגילה, האור עובר דרך הדגימה. במיקרוסקופ פלואורסצנציה, הרקע נשאר שחור מוחלט, ורק המבנה שאנחנו רוצים לראות "נדלק" בצבע בוהק. זה מאפשר לזהות אפילו מולקולות בודדות או וירוסים קטנים שפשוט היו נבלעים ברקע בשיטות אחרות.
.2 ספציפיות )צביעה ממוקדת(
זו היכולת החשובה ביותר. באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים, חוקרים יכולים לצבוע רק חלבון מסוים או אברון מסוים )כמו המיטוכונדריה.(
● דוגמה: מעבדה שחוקרת סרטן יכולה לצבוע חלבון שגורם לתא להתחלק ללא הפסקה בצבע אדום, ואת הDNA- בצבע כחול. כך הם יודעים בדיוק איפה החלבון המסוכן נמצא ומה הוא עושה.
.3 מעקב אחרי תאים חיים Imaging) (Live
בעבר, כדי לראות פרטים בתא היה צריך "לקבע" )להרוג( אותו ולצבוע אותו. פלואורסצנציה מאפשרת להחדיר לתא גנים של חלבונים זוהרים )כמו הGFP- המפורסם מהמדוזות.(
● זה מאפשר לחוקרים לצפות בתא בעודו חי: לראות איך הוא זז, איך הוא מגיב לתרופה, או איך וירוס חודר אליו בזמן אמת.
(Multiplexing) צבעים ריבוי .4
ניתן להשתמש בכמה צבעים פלואורסצנטיים בו-זמנית על אותה דגימה.
● אפשר לראות בתמונה אחת את הגרעין בכחול, את השלד התאי בירוק, ואת קרום התא באדום. זה מאפשר להבין את האינטראקציה בין חלקי התא השונים – מי נוגע במי ואיפה הם ממוקמים אחד ביחס לשני.
.5 אבחון רפואי מהיר
במעבדות קליניות )בבתי חולים,( משתמשים בזה לאבחון מחלות:
● זיהוי חיידקים: בדיקה מהירה להימצאות חיידקים ספציפיים.
● מחלות אוטואימוניות: זיהוי נוגדנים עצמיים בדם של חולה.
כיצד יודעים מתי הדגימה שלנו צריכה שימוש בטכניקת פלורסנציה ולא באור רגיל?
ההחלטה לעבור משימוש במיקרוסקופ אור רגיל (Brightfield) למיקרוסקופיה פלואורסצנטית נובעת בדרך כלל מהצורך בספציפיות וברגישות שמיקרוסקופיה רגילה פשוט לא יכולה לספק.
להלן המקרים העיקריים בהם תדע שהדגימה שלך דורשת פלואורסצנציה:
.1 כשהדגימה שקופה כמעט לחלוטין
רוב התאים החיים הם שקופים, והאור עובר דרכם מבלי ליצור ניגודיות )קונטרסט( משמעותית.
● באור רגיל: תראה "צללית" חיוורת של התא, ויהיה קשה להבחין באברונים פנימיים.
● בפלואורסצנציה: באמצעות צביעה ספציפית, ניתן לגרום רק לרכיבים מסוימים )כמו הגרעין או השלד התאי( "לזהור" על רקע שחור, מה שמאפשר לראות אותם בבירור מוחלט.
.2 כשצריך לזהות רכיב ספציפי בתוך התא
זהו היתרון המשמעותי ביותר במחקר ביולוגי ומעבדתי.
● הצורך: אם אתה רוצה לדעת איפה בדיוק נמצא חלבון מסוים או האם וירוס מסוים חדר לתא.
● הפתרון: שימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים שנדבקים רק למטרה שלך. אור רגיל יראה לך את כל התא, בעוד שהפלואורסצנציה תראה לך רק את ה"מטרות" שסימנת.
.3 עבודה עם תרביות תאים חיים Culture) (Cell
בתרביות תאים, התאים נוטים לשקוע ולהיצמד לתחתית הכלי.
● במיקרוסקופ מהופך )כמו הAE31E- של ,(Motic השילוב של פלואורסצנציה מאפשר לעקוב אחרי תהליכים גנטיים או חלבונים מסומנים )כמו (GFP בזמן אמת בתוך התא החי.
● היכולת לשלב ניגודיות פאזה Contrast) (Phase יחד עם פלואורסצנציה מאפשרת לראות בו-זמנית גם את מבנה התא וגם את הרכיב הזוהר בתוכו.
.4 כשנדרשת רגישות גבוהה מאוד
לפעמים כמות החומר שאנו מחפשים קטנה מכדי להיראות במיקרוסקופ אור רגיל.
● הפלואורסצנציה פועלת על עיקרון של "אור על רקע שחור" Noise) to ,(Signal מה שמאפשר לזהות אפילו מולקולות בודדות שזוהרות, דבר שבלתי אפשרי באור רגיל שבו הרקע הבהיר "בולע" פרטים קטנים.
לסיכום: מתי לבחור בפלואורסצנציה?
| פלואורסצנציה | אור רגיל / ניגודיות פאזה | הצורך שלכם |
| הכרחי לסימונים מורכבים יותר | מצוין לבדיקה כללית | בדיקת חיות )חי/מת( |
| המטודה הנבחרת | בלתי אפשרי | זיהוי חלבון ספציפי |
| פחות מתאים )רואים רק מה שצבוע( | מעולה )במיוחד בפאזה( | מורפולוגיה של התא |
| אידיאלי | לא ניתן לראות | מעקב גנטי (GFP) |
האם פלורסנציה דורש שימוש בפילטרים? אילו קיימים ואיך בוחרים פילטר?
כן, השימוש בפילטרים )מסננים( הוא לב לבו של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה. בלעדיהם, לא תוכל לראות דבר מלבד אור לבן חזק ומסנוור שיבלע את האות החלש מהדגימה.
המטרה של הפילטרים היא לבצע הפרדה מוחלטת בין האור שבו אנחנו משתמשים כדי "לעורר" את הצבע ,(Excitation) לבין האור שהצבע פולט חזרה .(Emission)
שלושת הפילטרים הקריטיים Cube) Filter (The
בתוך המיקרוסקופ קיימת יחידה שנקראת "קוביות פילטרים" Cubes) ,(Filter המכילה שלושה רכיבים אופטיים שעובדים יחד:
:(Excitation Filter) עירור פילטר .1
○ תפקיד: לסנן את האור ממקור האור )הלמפה או ה(LED- ולאפשר רק לאורך הגל הספציפי ש"מפעיל" את הצבע שלך לעבור.
○ דוגמה: אם אתה משתמש בצבע ירוק ,(GFP) הפילטר יעביר רק אור כחול 470nm) בערך.(
:(Dichroic Mirror/Beamsplitter) דיכרואיטית מראה .2
○ תפקיד: זוהי מראה "חכמה" שמוצבת בזווית של .45° היא מחזירה אורכי גל קצרים )אור העירור( לכיוון הדגימה, אבל שקופה לאורכי גל ארוכים יותר )אור הפליטה.(
○ חשיבות: היא מונעת מאור העירור המוחזר מהדגימה להגיע לעיניים שלך או למצלמה.
:(Emission / Barrier Filter) פליטה פילטר .3
○ תפקיד: ה"שומר" האחרון. הוא חוסם את שאריות אור העירור ומאפשר רק לאור הפלואורסצנטי הנקי לעבור לעינית.
○ תוצאה: אתה רואה עצם זוהר על רקע שחור מוחלט.
אילו סוגי פילטרים קיימים? )על פי רוחב הפס(
כשבוחרים פילטר, מסתכלים על טווח אורכי הגל שהוא מאפשר להעביר:
● (LP Pass :(Long מעביר את כל אורכי הגל שמעל סף מסוים )למשל: כל מה שמעל .(500nm מתאים כשיש צבע אחד ורוצים מקסימום אור, אבל פחות טוב אם יש כמה צבעים שעלולים להתערבב.
● (SP Pass :(Short מעביר רק אורכי גל קצרים מסף מסוים. בדרך כלל משמש כפילטר עירור.
● (BP Pass :(Band היעיל ביותר למחקר. הוא מעביר רק "חלון" צר של אור )למשל: בין 520nm ל.(550nm- זה קריטי כשעובדים עם מספר צבעים בו-זמנית (Multiplexing) כדי למנוע "זליגה" (Bleed-through) של צבע אחד לשני.
איך בוחרים את הפילטר הנכון?
הבחירה תמיד מתחילה בפלואורופור )הצבע( שבו השתמשת. לכל צבע יש "ספקטרום" ייחודי המורכב משתי עקומות: עקומת עירור ועקומת פליטה.
השלבים לבחירה:
.1 זיהוי שיא העירור: מצא באיזה אורך גל הצבע שלך נטען הכי טוב )למשל 488nm ל.(FITC- בחר פילטר עירור שמרכזו בנקודה זו.
.2 זיהוי שיא הפליטה: מצא באיזה צבע הוא זוהר )למשל .(520nm בחר פילטר פליטה שמתאים לטווח הזה.
.3 מניעת חפיפה: ודא שפילטר העירור ופילטר הפליטה לא חופפים. אם יש חפיפה, תראה אור רקע שיפריע לתמונה.
.4 התאמת המראה הדיכרואיטית: היא חייבת להיות מסוגלת להחזיר את אור העירור ולהעביר את אור הפליטה )הנקודה שבה היא משתנה נקראת .("Cut-off"
טיפ מעבדתי: רוב המיקרוסקופים מגיעים עם "סטים" מוכנים מראש לצבעים נפוצים כמו DAPI
.(אדום) TRITC/Texas Red-ו (ירוק) GFP/FITC ,(כחול)
אילו דגמים של מיקרוסקופים קיימים עם פלורסנציה?
קיימים דגמים של מיקרוסקופ עומד (Upright) ומיקרוסקופ מהופך (Inverted) המצוידים במערכות פלואורסצנציה. הבחירה ביניהם תלויה כמעט לחלוטין בסוג הדגימה שלך ובאופן שבו היא מוחזקת )בתוך צלחת עם נוזל או על סלייד זכוכית.(
הנה ההבדלים והשימושים העיקריים לכל דגם:
.1 מיקרוסקופ פלואורסצנציה עומד (Upright)
במבנה זה, עדשות האובייקטיב נמצאות מעל הדגימה, ומקור האור )או הפילטרים( מקרינים מלמעלה למטה.
● למי זה מתאים: עבודה עם דגימות קבועות (Fixed) שנמצאות על גבי סלייד זכוכית ומכוסות בזכוכית מכסה .(Coverslip)
● יתרונות:
○ מרחק עבודה קצר המאפשר שימוש בעדשות עם מפתח נומרי ($NA$) גבוה מאוד )תמונות חדות ובהירות יותר.(
○ נוח מאוד לצפייה בחתכי רקמות דקים )כמו חתכי מוח או כבד.(
● חסרונות: לא ניתן להסתכל דרכו על תאים שגדלים בתוך צלחת פטרי או בקבוק תרבית, כי העדשה תיתקע בדופן הפלסטיק או שהמרחק יהיה גדול מדי.
.2 מיקרוסקופ פלואורסצנציה מהופך (Inverted)
במבנה זה, העדשות נמצאות מתחת לבמה (Stage) ומסתכלות על הדגימה מלמטה.
Explore
● למי זה מתאים: עבודה עם תאים חיים הגדלים בתוך כלים )צלחות פטרי, Multi-well plates או בקבוקי תרבית.(
● יתרונות:
○ התאים שוקעים לתחתית הצלחת, ולכן העדשה שנמצאת למטה קרובה אליהם מאוד.
○ מאפשר להוסיף מעל הדגימה מערכות אינקובציה )טמפרטורה וגזים( או מיקרו-מניפולטורים מבלי שהעדשה תפריע.
● חסרונות: דורש לעיתים עדשות מיוחדות Distance") Working ("Long שיכולות "לראות" דרך עובי הפלסטיק של צלחת התרבית.
| מאפיין | מיקרוסקופ עומד (Upright) | מיקרוסקופ מהופך (Inverted) |
| מיקום העדשה | מעל הדגימה | מתחת לדגימה |
| סוג דגימה אידיאלי | סליידים )זכוכית נוגעת בזכוכית( | תאים חיים בצלחות/בקבוקים |
| שימוש נפוץ | פתולוגיה, אבחון חיידקים, רקמות | ביולוגיה תאית, תרביות תאים, IVF |
| יכולת הרחבה | מוגבלת יותר )פחות מקום מעל הדגימה( | גבוהה )אינקובטורים, הזרקות( |
באילו דגמים של MOTIC יש אופציה לפלורסנציה?
הנה הרשימה המעודכנת של דגמי Motic עם אופציה לפלואורסצנציה:
זהו הדגם המוכר ביותר שלהם למחקר תאים חיים.
● האופציה: ניתן להרכיב עליו יחידת Epi-Fluorescence מלאה )בדרך כלל עם מנורת כספית 100W או מערכות LED חיצוניות.(
ספינת הדגל של המיקרוסקופים העומדים של .Motic
● האופציה: מתוכנן מראש עם נתיב אופטי רחב שמתאים לפלואורסצנציה עוצמתית. הוא תומך בקוביות פילטרים מתחלפות ובעדשות הFluuar- Plan EC-H האיכותיות שלהם.
מה היתרון בדגמים הפלורסנטיים של היצרן MOTIC מאשר יצרנים אחרים? ומה לגבי אופציה למצלמה ותוכנה של ?MOTIC
רכישת מערכת פלואורסצנטית של Motic )במיוחד הBA410E- העומד או הAE31E- המהופך( מעניקה יתרונות פרקטיים מאוד למעבדות שלא זקוקות ל"חללית" ממונעת, אלא לסוס עבודה אמין.
הנה הניתוח של היתרונות, עם דגש על נושא הצילום והתוכנה:
(The Hardware Advantage) והמבני הכלכלי היתרון .1
● מחיר "נגיש" לפלואורסצנציה מקצועית: בעוד שיצרנים כמו Zeiss או Nikon מתמחרים מערכות פלואורסצנציה כ"מוצרי יוקרה," Motic מציעה אופטיקה ברמה מחקרית Fluuar) (Plan במחיר שמאפשר למעבדות קטנות או בינוניות להחזיק מכשיר איכותי משלהן במקום להסתמך על יחידות מרכזיות.
● עמידות בתנאי עבודה קשים: המערכות של Motic )במיוחד ה(BA410E- בנויות משילדת מתכת מאסיבית מאוד. הן פחות רגישות לתקלות אלקטרוניות מורכבות שיש בדגמים ממונעים של חברות אחרות.
.2 מצלמות :Moticam האופטיקה הדיגיטלית
Motic היא אחת היצרניות הבודדות שמפתחת גם את המיקרוסקופ וגם את המצלמה תחת קורת גג אחת.
● התאמה אופטית מלאה: המצלמות )סדרת ה(Moticam- מגיעות עם מתאמים אופטיים (C-Mount) שעברו אופטימיזציה לעדשות של .Motic זה מונע עיוותים בשולי התמונה (Vignetting) שקורים לעיתים כשמערבבים יצרנים שונים.
● רגישות לפלואורסצנציה: למחקר פלואורסצנטי, Motic מציעה מצלמות מסדרת הsCMOS- או מצלמות עם קירור .(Cooled) זהו יתרון קריטי – הן מסוגלות לקלוט אותות חלשים מאוד מבלי לייצר "רעש" דיגיטלי )שלג( בתמונה.
Motic Analysis-ו Motic Images Plus תוכנת .3
היתרון הגדול כאן הוא הפשטות והמחיר:
● תוכנה כלולה: ברוב המקרים, התוכנה הבסיסית מגיעה כחלק מחבילת המצלמה ללא תשלום נוסף על רישיון )בניגוד ליצרנים אחרים שגובים אלפי דולרים רק על התוכנה.(
● עיבוד תמונה ייעודי לפלואורסצנציה:
○ Stitching :Image חיבור של כמה תמונות לתמונה אחת גדולה )פסיפס.(
(FITC) ירוק ,(DAPI) בכחול תמונה לצלם היכולת :Multi-Channel Overlay ○
ואדום (TRITC) ולמזג אותן בלחיצת כפתור לתמונה צבעונית אחת מדויקת.
○ מדידות: כלים למדידת עוצמת האור Intensity) ,(Fluorescence מדידת שטחים וספירת תאים אוטומטית.
.4 תחזוקה ושירות
● חלקי חילוף זמינים: מכיוון שמדובר במערכות מכניות ואופטיות סטנדרטיות, קל מאוד למצוא נורות HBO חלופיות, פילטרים או חלקים במחירים הגיוניים.
● פשטות תפעול: התוכנה של Motic נחשבת ל"ידידותית למשתמש" Friendly) (User בהשוואה לתוכנות מחקר כבדות כמו NIS-Elements או ,ZEN מה שמקצר את זמן הלמידה של סטודנטים או עובדי מעבדה חדשים.
לסיכום - למה לקנות Motic לפלואורסצנציה?
אם אתה מחפש מערכת שתיתן לך תמונות באיכות פרסום למאמרים, אמינות מכנית גבוהה, ותוכנה קלה להפעלה – כל זאת בתקציב שפוי – Motic היא הבחירה הכי חכמה בשוק כיום. היא "סוס עבודה" שלא דורש טכנאי צמוד לכל לחיצת כפתור.
המלצה: כשאתה רוכש, ודא שאתה מקבל מצלמה מסוג sCMOS או מצלמה עם רזולוציה גבוהה )לפחות (5MP-10MP כדי לנצל את האופטיקה המצוינת של
.AE31E-ה או BA410E-ה