כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים, המוכרת בשם HPLC, היא אחת משיטות האנליזה המרכזיות בתעשיית התרופות. השיטה מאפשרת להפריד בין מרכיבים שונים הנמצאים בדגימה, לזהות אותם ולמדוד את ריכוזם ברמת דיוק גבוהה.
מערכות HPLC משמשות לאורך מחזור החיים של המוצר התרופתי: החל משלב המחקר והפיתוח, דרך בדיקות חומרי גלם ופיתוח פורמולציות, ועד לשחרור אצוות, בדיקות יציבות, זיהוי תוצרי פירוק ובקרת איכות שוטפת.
היכולת לנתח תערובות מורכבות ולהבדיל בין החומר הפעיל, חומרי העזר, זיהומים ותוצרי פירוק הופכת את טכנולוגיית HPLC לכלי משמעותי במעבדות פרמצבטיות, במפעלי ייצור תרופות ובמעבדות מחקר.
מהי מערכת HPLC וכיצד היא פועלת?
HPLCהיא שיטת הפרדה אנליטית המבוססת על העברת דגימה נוזלית דרך עמודה כרומטוגרפית בלחץ גבוה. בתוך העמודה נמצאת הפאזה הנייחת, בעוד שהממס או תערובת הממסים העוברים דרכה נקראים הפאזה הניידת.
מרכיבי הדגימה מגיבים באופן שונה עם הפאזה הנייחת והפאזה הניידת. כתוצאה מכך, כל חומר נע דרך העמודה במהירות שונה ומגיע אל הגלאי בזמן אחר.
התוצאה מוצגת באמצעות כרומטוגרמה הכוללת פסגות. כל פסגה יכולה לייצג חומר מסוים בדגימה, בעוד ששטח הפסגה או גובהה משמשים בדרך כלל לצורך חישוב כמותי.
פרק USP <621> מתאר את העקרונות הכלליים של שיטות כרומטוגרפיות, את הפרמטרים המקובלים ואת הדרישות לבדיקת התאמת המערכת לפני ביצוע האנליזה.
מדוע HPLC חשובה בתעשיית התרופות?
מוצר תרופתי חייב לעמוד בדרישות מוגדרות של זהות, חוזק, איכות וטוהר. מפרט המוצר כולל בדיקות, שיטות אנליטיות וקריטריונים לקבלה, אשר קובעים האם חומר הגלם או המוצר המוגמר מתאים לשימוש ולשחרור.
הנחיות ICH Q6A מגדירות מפרט תרופתי כמערכת הכוללת בדיקות, הפניות לשיטות אנליטיות וגבולות קבלה מתאימים. מערכות HPLC מאפשרות לבצע חלק ניכר מהבדיקות הכימיות הנדרשות במסגרת מפרטים אלו.
היתרונות העיקריים של HPLC בתעשיית התרופות כוללים:
- יכולת הפרדה בין חומרים בעלי מבנה כימי דומה
- מדידה כמותית של החומר הפעיל
- זיהוי זיהומים בריכוזים נמוכים
- מעקב אחר תוצרי פירוק
- התאמה למגוון רחב של חומרים שאינם נדיפים
- אפשרות לחיבור לגלאים מסוגים שונים
- יכולת לפתח שיטות סלקטיביות למוצרים מורכבים
- תיעוד ממוחשב של תוצאות האנליזה
בדיקת תכולת החומר הפעיל
אחד השימושים הנפוצים ביותר ב-HPLC הוא קביעת תכולת החומר הפעיל, המכונה Assay.
בבדיקה זו משווים את תגובת הדגימה לתגובה המתקבלת מתמיסת סטנדרט בריכוז ידוע. על בסיס שטחי הפסגות, ריכוזי התמיסות, משקל הדגימה ונתוני ההכנה ניתן לחשב את כמות החומר הפעיל במוצר.
בדיקת תכולה באמצעות HPLC מתבצעת במוצרים רבים, בהם:
- טבליות וקפסולות
- תמיסות וסירופים
- משחות וקרמים
- תכשירים להזרקה
- טיפות עיניים
- חומרי גלם פעילים
- מוצרים ביולוגיים מסוימים
- תרופות משולבות המכילות מספר חומרים פעילים
השיטה מאפשרת לבדוק האם המוצר מכיל את כמות החומר הפעיל שהוגדרה במפרט. תוצאה נמוכה מדי עלולה להצביע על מינון חסר, פירוק או בעיה בתהליך הייצור. תוצאה גבוהה מדי עלולה להצביע על חריגה בשקילה, בערבוב או בתהליך המילוי.
בדיקות זהות של חומרי גלם ומוצרים
ניתן להשתמש ב-HPLC כדי לסייע באימות זהותו של חומר פעיל או של מרכיב אחר בדגימה.
אחד הפרמטרים הנבדקים הוא זמן השהייה, Retention Time. משווים בין זמן השהייה של הפסגה המרכזית בדגימה לבין זמן השהייה של סטנדרט מוכר שנבדק באותם תנאים.
עם זאת, זמן שהייה יחיד אינו תמיד מספק כהוכחה מלאה לזהות החומר. הנחיות ICH Q6A מציינות כי זיהוי המבוסס רק על זמן שהייה כרומטוגרפי יחיד אינו נחשב בהכרח ספציפי מספיק. ניתן לחזק את הזיהוי באמצעות גלאי מערך דיודות, HPLC-MS, שיטה כרומטוגרפית נוספת או בדיקה אנליטית משלימה.
זיהוי וכימות של זיהומים
זיהומים עלולים להימצא בחומר הפעיל, בחומרי הגלם או במוצר המוגמר. מקורם עשוי להיות בתהליך הסינתזה, בחומרי המוצא, בתוצרי לוואי, בשאריות תהליך או בתהליכי פירוק המתרחשים במהלך האחסון.
מערכות HPLC משמשות לבדיקת:
- זיהומים ידועים
- זיהומים לא מזוהים
- תוצרי לוואי מתהליך הייצור
- תוצרי פירוק
- חומרים קרובים מבחינה מבנית
- שאריות של חומרי מוצא
- חומרים שנוצרו כתוצאה מאינטראקציה עם האריזה
הנחיות ICH Q3A מתייחסות לצורך בבקרה על זיהומים אורגניים מזוהים ולא מזוהים בחומרים תרופתיים חדשים. הנחיות ICH Q3B עוסקות בזיהומים ובתוצרי פירוק במוצרים תרופתיים מוגמרים.
בבדיקות זיהומים נדרשת בדרך כלל רגישות גבוהה יותר מזו הנדרשת בבדיקת תכולה. לכן יש לבחור גלאי, עמודה, נפח הזרקה וריכוז דגימה המאפשרים למדוד גם פסגות קטנות בצורה אמינה.
בדיקות יציבות ותוצרי פירוק
בדיקות יציבות נועדו לקבוע כיצד איכות התרופה משתנה לאורך זמן בתנאי אחסון מוגדרים. במסגרת הבדיקות מאחסנים דגימות בטמפרטורה, בלחות ובתנאי תאורה שונים, ולאחר מכן מנתחים אותן בנקודות זמן מתוכננות.
באמצעות HPLC ניתן לבדוק:
- ירידה בריכוז החומר הפעיל
- הופעת תוצרי פירוק חדשים
- עלייה ברמת זיהומים קיימים
- שינויים בפרופיל הכרומטוגרפי
- השפעת הטמפרטורה והלחות
- השפעת האור על יציבות המוצר
- השפעת חומרי האריזה
לצורך בדיקות יציבות יש צורך בשיטה המעידה על יציבות, Stability-Indicating Method. שיטה כזו צריכה להיות מסוגלת להפריד את החומר הפעיל מתוצרי הפירוק וממרכיבים אחרים בדגימה.
הנחיות ICH Q2(R2) ו-Q14 חלות על שיטות המשמשות, בין היתר, לבדיקות שחרור ולבדיקות יציבות של חומרים תרופתיים ומוצרים מסחריים.
בדיקות שחרור אצווה
לפני שאצוות ייצור מאושרות לשיווק, מעבדת בקרת האיכות מבצעת סדרה של בדיקות בהתאם למפרט המאושר.
בדיקות HPLC אפשריות במסגרת שחרור אצווה כוללות:
| סוג הבדיקה | מטרת הבדיקה |
| Assay | קביעת תכולת החומר הפעיל |
| Related Substances | בדיקת זיהומים וחומרים קרובים |
| Identification | אימות זהות החומר הפעיל |
| Content Uniformity | בדיקת אחידות בין יחידות מינון |
| Dissolution | מדידת קצב וכמות שחרור החומר הפעיל |
| Preservative Content | קביעת ריכוז חומרים משמרים |
| Degradation Products | איתור וכימות תוצרי פירוק |
| Cleaning Verification | בדיקת שאריות לאחר ניקוי ציוד |
התוצאות מושוות לקריטריונים שנקבעו במפרט. אצווה שאינה עומדת באחד הקריטריונים עשויה לעבור חקירה, בדיקות נוספות או פסילה, בהתאם לנהלים ולממצאים.
בדיקות אחידות תכולה
במוצרים המחולקים ליחידות מינון, כגון טבליות וקפסולות, לא מספיק לבדוק רק את הממוצע של מספר יחידות יחד. לעיתים יש צורך למדוד את כמות החומר הפעיל בכל יחידה בנפרד.
בדיקת אחידות תכולה מאפשרת לוודא שכל טבליה או קפסולה מכילה מינון הנמצא בתחום הקבלה המוגדר.
השימוש ב-HPLC מתאים במיוחד כאשר:
- מינון החומר הפעיל נמוך
- המוצר כולל מספר חומרים פעילים
- נדרשת סלקטיביות גבוהה
- קיימים חומרי עזר העלולים להפריע לשיטות פשוטות יותר
- יש צורך לכמת כל חומר פעיל בנפרד
בדיקות המסה ושחרור התרופה
בדיקת המסה, Dissolution, בוחנת את קצב שחרור החומר הפעיל מטבליה, קפסולה או צורת מינון אחרת לתוך מדיום נוזלי.
בשלבים שונים במהלך הבדיקה נלקחות דגימות מכלי ההמסה. לאחר סינון או הכנה מתאימה, הדגימות מוזרקות למערכת HPLC לצורך מדידת ריכוז החומר הפעיל.
שילוב בין מערכת המסה לבין HPLC מאפשר:
- מדידה סלקטיבית של החומר הפעיל
- הפרדה מחומרי עזר ומרכיבי המדיום
- בדיקת מוצרים המכילים מספר חומרים פעילים
- יצירת פרופיל שחרור לאורך זמן
- השוואה בין אצוות או פורמולציות שונות
- הערכת השפעת שינויים בתהליך הייצור
בדיקת חומרים משמרים ותוספים
מוצרים נוזליים, תכשירים רב-מנתיים, קרמים ומוצרים סטריליים מסוימים עשויים להכיל חומרים משמרים. באמצעות HPLC ניתן למדוד את ריכוזם ולוודא שהוא נמצא בטווח המתאים.
בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה לבדיקת:
- נוגדי חמצון
- ממתיקים
- צבעים
- מייצבים
- חומרים פעילי שטח
- ויטמינים
- תוספים פונקציונליים אחרים
שיטה מתאימה צריכה להפריד בין התוספים לבין החומר הפעיל, חומרי העזר ותוצרי הפירוק האפשריים.
שימוש ב-HPLC בפיתוח תרופות
בשלבי המחקר והפיתוח משמשת HPLC להבנת התכונות הכימיות של החומר ולבניית שיטות אנליטיות המתאימות למוצר העתידי.
השימושים כוללים:
- אפיון חומר פעיל חדש
- בדיקת טוהר
- מעקב אחר תהליך סינתזה
- השוואה בין פורמולציות
- בחירת חומרי עזר
- הערכת יציבות מוקדמת
- פיתוח תנאי הפרדה
- קביעת פרופיל זיהומים
- תמיכה בהעברת שיטה למעבדת בקרת איכות
הנחיית ICH Q14 מעודדת פיתוח שיטות אנליטיות באמצעות גישה מדעית ומבוססת סיכונים. ההנחיה מתייחסת לפיתוח, לתחזוקה ולניהול השיטה לאורך מחזור החיים שלה, ולא רק לביצוע ולידציה חד-פעמית.
פיתוח שיטת HPLC
פיתוח שיטת HPLC כולל התאמה של מספר פרמטרים המשפיעים על ההפרדה ועל איכות התוצאה.
בין הפרמטרים המרכזיים:
- סוג העמודה
- אורך וקוטר העמודה
- גודל חלקיקי המילוי
- סוג הפאזה הנייחת
- הרכב הפאזה הניידת
- ערך ה-pH
- סוג וכמות הבאפר
- קצב הזרימה
- טמפרטורת העמודה
- אורך הגל של הגלאי
- נפח ההזרקה
- ריכוז הדגימה
- תנאי גרדיאנט או עבודה איזוקרטית
- זמן הריצה
המטרה אינה רק לקבל פסגות יפות, אלא לפתח שיטה המספקת סלקטיביות, דיוק, רגישות ועמידות המתאימים למטרת הבדיקה.
ולידציה של שיטות HPLC
לאחר פיתוח השיטה יש להוכיח באופן מתועד שהיא מתאימה לשימוש המיועד. תהליך זה נקרא ולידציה של שיטה אנליטית.
ICH Q2(R2) מגדירה עקרונות לבחירת בדיקות הוולידציה ולהערכת ביצועי השיטה. היקף הוולידציה תלוי במטרת השיטה, בסוג התוצאה המדווחת ובסיכון הכרוך בהחלטות המתקבלות על בסיסה.
מאפייני ולידציה אפשריים כוללים:
ספציפיות וסלקטיביות
יכולת השיטה למדוד את החומר המבוקש בנוכחות מרכיבים אחרים, כגון חומרי עזר, זיהומים ותוצרי פירוק.
לינאריות
היכולת לקבל תגובה אנליטית הנמצאת ביחס מתאים לריכוז החומר בתחום שנבדק.
דיוק
מידת הקרבה בין התוצאה שהתקבלה לבין הערך האמיתי או הערך המקובל.
חזרתיות
מידת ההתאמה בין תוצאות המתקבלות בבדיקות חוזרות בתנאים זהים.
דיוק ביניים
בחינת השפעת שינויים כגון ימים שונים, אנליסטים שונים, ציוד שונה או עמודות שונות באותה מעבדה.
טווח עבודה
תחום הריכוזים שבו הוכח כי השיטה מספקת ביצועים מתאימים.
גבול גילוי וגבול כימות
הריכוז הנמוך ביותר שניתן לזהות, והריכוז הנמוך ביותר שניתן לכמת ברמת ביצועים מספקת.
עמידות השיטה
בדיקת השפעתם של שינויים קטנים ומבוקרים בפרמטרים כמו pH, קצב זרימה, טמפרטורה והרכב הפאזה הניידת.
בדיקת התאמת מערכת
לפני ניתוח דגימות יש לוודא שהמערכת הכרומטוגרפית פועלת כנדרש. בדיקה זו נקראת System Suitability Test.
הפרמטרים עשויים לכלול:
- חזרתיות של שטחי הפסגות
- חזרתיות של זמני השהייה
- רזולוציה בין פסגות קריטיות
- גורם זנב או סימטריית פסגה
- מספר פלטות תאורטיות
- יחס אות לרעש
- רגישות המערכת
USP <621> מאפשרת לבצע התאמות מסוימות בתנאים הכרומטוגרפיים, אך נדרש לוודא לאחר השינוי כי ביצועי השיטה והתאמת המערכת נשמרו.
HPLC ובדיקות ניקיון של ציוד ייצור
לאחר ייצור מוצר תרופתי יש לנקות את הציוד כדי למנוע מעבר של שאריות למוצר הבא. HPLC יכולה לשמש לזיהוי וכימות של שאריות חומר פעיל על פני הציוד או במי השטיפה.
בבדיקות אלו משתמשים בדרך כלל ב:
- דגימות מטוש ממשטחי הציוד
- דגימות ממי השטיפה
- תמיסות מיצוי
- סטנדרטים בריכוזים נמוכים
שיטת הבדיקה צריכה להיות רגישה מספיק כדי למדוד שאריות ברמות הנמוכות מגבול הקבלה שנקבע במסגרת ולידציית הניקיון.
סוגי גלאים למערכות HPLC בתעשיית התרופות
גלאי UV או VIS
זהו אחד הגלאים הנפוצים ביותר. הוא מתאים לחומרים הסופגים קרינה באורך גל מוגדר.
גלאי מערך דיודות
גלאי DAD או PDA אוסף מידע במספר אורכי גל ויכול לספק מידע נוסף על ספקטרום הבליעה ועל טוהר הפסגה.
גלאי פלואורסצנציה
מתאים לחומרים פלואורסצנטיים או לחומרים שניתן לבצע להם תגובת נגזרת. הוא עשוי לספק רגישות וסלקטיביות גבוהות.
גלאי אינדקס שבירה
משמש לחומרים שאינם סופגים היטב בתחום ה-UV, כגון סוכרים מסוימים. הוא רגיש יחסית לשינויים בטמפרטורה ובהרכב הפאזה הניידת.
גלאי מסות
חיבור HPLC למערכת ספקטרומטריית מסות מאפשר לקבל מידע על המסה של התרכובת ולשפר את יכולת הזיהוי והכימות. השילוב נפוץ במחקר, באפיון זיהומים, בבדיקות מטבוליטים ובאנליזה ביו-פרמצבטית.
שלמות נתונים ותיעוד תוצאות HPLC
בתעשיית התרופות, איכות האנליזה תלויה לא רק בביצועי המכשיר אלא גם בשלמות הנתונים.
מערכת הנתונים צריכה לאפשר שמירה של:
- נתוני המקור
- כרומטוגרמות
- רצפי ההזרקה
- שיטות העיבוד
- חישובים
- פעולות אינטגרציה
- שינויים שבוצעו בתוצאות
- פרטי המשתמש
- תאריך ושעת הפעולה
- תיעוד ביקורת מתאים
הנחיות ה-FDA בנושא שלמות נתונים מדגישות את החשיבות של נתונים מלאים, עקביים ומדויקים לאורך מחזור החיים שלהם. דרישות לרשומות ולחתימות אלקטרוניות עשויות לחול במסגרת 21 CFR Part 11, בהתאם לאופן השימוש ברשומות האלקטרוניות.
טיפול בתוצאות חריגות
כאשר מתקבלת תוצאה החורגת מהמפרט, Out of Specification, אין לפסול אותה או לחזור על הבדיקה ללא חקירה מתועדת.
החקירה עשויה לכלול בדיקה של:
- הכנת הדגימה
- הכנת הסטנדרט
- חישובים ודילולים
- מצב העמודה
- התאמת המערכת
- רצף ההזרקות
- לחץ המערכת
- יציבות התמיסות
- ביצועי הגלאי
- אינטגרציית הפסגות
- יומני המכשיר ונתוני המקור
הנחיות ה-FDA בנושא OOS חלות על בדיקות כימיות של חומרי גלם פעילים, חומרי עזר, חומרים בתהליך ומוצרים תרופתיים מוגמרים. הן מדגישות את אחריות המעבדה לבצע חקירה מדעית ומלאה של התוצאה החריגה.
כיצד לבחור מערכת HPLC למעבדה פרמצבטית?
בבחירת מערכת יש להתייחס לאופי הבדיקות, לכמות הדגימות ולדרישות הרגולטוריות של המעבדה.
פרמטרים חשובים כוללים:
- טווח הלחצים של המערכת
- דיוק וחזרתיות המשאבה
- מספר הממסים שניתן לשלב
- אפשרות לעבודה איזוקרטית או בגרדיאנט
- קיבולת הדוגם האוטומטי
- בקרת טמפרטורה של הדגימות
- תנור עמודות
- סוג הגלאי
- טווח אורכי הגל
- רגישות ורעש בסיס
- נפח השהיה של המערכת
- תוכנת איסוף ועיבוד נתונים
- ניהול הרשאות משתמשים
- Audit Trail
- אפשרויות גיבוי וייצוא
- זמינות שירות, תחזוקה וחלקי חילוף
מעבדה המבצעת בדיקות שגרתיות רבות עשויה להעדיף מערכת עם דוגם אוטומטי גדול ותוכנה המאפשרת בניית רצפי עבודה. מעבדת פיתוח עשויה להזדקק לגמישות גבוהה יותר, למספר גלאים ולאפשרות עבודה עם מגוון רחב של עמודות וממסים.
סיכום
מערכות HPLC ממלאות תפקיד מרכזי בתעשיית התרופות ובבקרת איכות. הן משמשות לקביעת תכולת החומר הפעיל, לזיהוי זיהומים, למעקב אחר תוצרי פירוק, לבדיקות יציבות, לבדיקות אחידות תכולה, לניתוח דגימות המסה ולשחרור אצוות ייצור.
כדי לקבל תוצאות אמינות, אין די בבחירת מערכת מתאימה. נדרשים גם פיתוח שיטה נכון, ולידציה בהתאם למטרת השימוש, בדיקות התאמת מערכת, תחזוקה שוטפת, הכשרת משתמשים ושמירה מלאה על שלמות הנתונים.
יישום נכון של טכנולוגיית HPLC מאפשר למעבדות פרמצבטיות לקבל מידע מדויק על איכות המוצר, לזהות חריגות בשלב מוקדם ולתמוך בייצור תרופות עקביות, איכותיות ובטוחות.
שאלות נפוצות על HPLC בתעשיית התרופות
למה משתמשים ב-HPLC בבקרת איכות תרופות?
השיטה מאפשרת לזהות ולכמת חומרים פעילים, זיהומים ותוצרי פירוק בתערובות מורכבות וברמת סלקטיביות גבוהה.
האם HPLC מתאימה לבדיקת כל סוגי התרופות?
HPLC מתאימה למגוון רחב מאוד של תרכובות, במיוחד לחומרים שאינם נדיפים או שאינם מתאימים לניתוח באמצעות כרומטוגרפיית גז. עם זאת, יש להתאים את השיטה, העמודה והגלאי לתכונות החומר.
מה ההבדל בין בדיקת Assay לבדיקת זיהומים?
בדיקת Assay מודדת את כמות החומר הפעיל העיקרי. בדיקת זיהומים מתמקדת בחומרים הנמצאים בדרך כלל בריכוזים נמוכים יותר, ולכן היא עשויה לדרוש רגישות גבוהה ותנאי הפרדה מחמירים יותר.
מהי שיטת HPLC המעידה על יציבות?
זוהי שיטה המסוגלת למדוד את החומר הפעיל באופן סלקטיבי גם בנוכחות זיהומים, חומרי עזר ותוצרי פירוק שנוצרים במהלך האחסון.
מדוע מבצעים בדיקת System Suitability?
הבדיקה נועדה לוודא שהמערכת, העמודה והשיטה מספקות את ביצועי ההפרדה, הרגישות והחזרתיות הנדרשים לפני ניתוח הדגימות.
האם שינוי עמודת HPLC מחייב ולידציה מחדש?
לא כל שינוי מחייב ולידציה מלאה, אך יש להעריך את השפעתו על ביצועי השיטה. בהתאם להיקף השינוי, ייתכן שיידרשו בדיקת התאמה, אימות חלקי או ולידציה מחדש.